Secuenciación genética: Perspectivas tecnológicas y su profundo impacto en la humanidad

La ADN polimerasa desempeña un papel crucial en el diagnóstico molecular, lo que se refleja principalmente en los siguientes aspectos:

• Reacción en cadena de polimerasa (PCR)
  • Amplificación de ADNLa PCR es una técnica común en el diagnóstico molecular para amplificar fragmentos específicos de ADN y hacerlos detectables y analizables. La ADN polimerasa es la enzima principal de la reacción de PCR. Utiliza ADN monocatenario como molde y, según el principio de apareamiento complementario de bases, añade desoxinucleótidos libres uno a uno al extremo 3'-OH del cebador para sintetizar una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena molde, logrando así una amplificación exponencial del fragmento de ADN. Mediante la PCR, se pueden amplificar trazas de muestras de ADN a un nivel detectable, lo que aumenta la sensibilidad de la detección.
  • Garantizar la precisión de la amplificaciónLa ADN polimerasa de alta fidelidad posee actividad exonucleasa 3'→5', que corrige la incorporación incorrecta de nucleótidos durante la síntesis de ADN. Elimina oportunamente las bases incorrectamente apareadas y añade las bases correctas, reduciendo así la tasa de error durante la amplificación por PCR y garantizando la precisión del producto amplificado, proporcionando una muestra de ADN fiable para el posterior análisis diagnóstico.
• PCR cuantitativa fluorescente (qPCR)
  • Análisis cuantitativoEn la qPCR, la ADN polimerasa también es responsable de la amplificación del ADN. Al añadir un grupo fluorescente al sistema de reacción de PCR, el proceso de amplificación por PCR puede monitorizarse en tiempo real mediante el cambio en la señal fluorescente. Mientras la ADN polimerasa amplifica el ADN, la señal fluorescente aumenta a medida que aumenta el número de copias. Según el número de ciclos (valor Ct), cuando la señal fluorescente alcanza el umbral establecido, se puede analizar cuantitativamente el ADN molde inicial. Esto es fundamental para la monitorización de la carga patógena, el análisis cuantitativo de la expresión génica, etc., y resulta útil para el diagnóstico de enfermedades, la monitorización del tratamiento y la evaluación del pronóstico.
• Secuenciación de genes
  • Síntesis de ADN para reacciones de secuenciaciónEn el método de secuenciación de Sanger, la ADN polimerasa se utiliza para sintetizar una nueva cadena complementaria al ADN molde. Además de los desoxinucleótidos normales, se añade al sistema de reacción una pequeña cantidad de didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia (ddNTP). Cuando el ddNTP se incorpora aleatoriamente a la cadena de ADN que se está sintetizando, interrumpe su extensión, generando una serie de fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estos fragmentos se separan mediante electroforesis y se detectan por fluorescencia, lo que permite determinar la secuencia de ADN. En las tecnologías de secuenciación de nueva generación, como las de segunda generación basadas en el principio de secuenciación por síntesis, la ADN polimerasa también es una enzima clave para la síntesis y secuenciación de ADN, ya que garantiza la adición precisa de nucleótidos en cada ciclo y determina la secuencia de ADN mediante la detección de la incorporación de nucleótidos.
• Genotipado
  • Amplificación específica de alelosEn algunos métodos de genotipificación, las características de la ADN polimerasa se utilizan para la amplificación específica de alelos. Al diseñar cebadores específicos que son complementarios a las bases específicas del alelo diana en el extremo 3', la ADN polimerasa puede extender eficazmente los cebadores solo cuando estos coinciden completamente con el molde. De esta manera, se pueden distinguir diferentes alelos, lo cual se utiliza para la genotipificación de genes relacionados con enfermedades, la investigación farmacogenómica, etc., ayudando a los médicos a desarrollar planes de tratamiento personalizados según las características genéticas de los pacientes.
• Hibridación molecular de ácidos nucleicos
  • Etiquetado de sondaEn la tecnología de hibridación molecular de ácidos nucleicos, las sondas de ADN deben marcarse para su detección. La ADN polimerasa puede utilizarse para marcar sondas mediante métodos como la traducción de mellas o el método de cebadores aleatorios. Por ejemplo, en el método de traducción de mellas, la ADNasa I se utiliza primero para generar mellas monocatenarias en la sonda de ADN. A continuación, la ADN polimerasa I utiliza su actividad exonucleasa 5'→3' para escindir un segmento de ADN en la mella y, simultáneamente, utiliza su actividad polimerasa 5'→3' para añadir desoxinucleótidos marcados al extremo 3' de la mella, preparando así una sonda de ADN marcada para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos.