La detección de Mycoplasma con un hisopo generalmente implica varios pasos, que incluyen la recolección de muestras, la extracción de ADN y las pruebas moleculares. Aquí hay un resumen general del proceso:
Materiales necesitados:
- Hisopos estériles
- Medio de transporte (p. ej., PBS o medio de transporte específico de Mycoplasma)
- kit de extracción de ADN
- Reactivos y equipos de PCR.
- Cebadores específicos para la detección de Mycoplasma
- Aparato de electroforesis en gel o máquina de PCR en tiempo real.
Procedimiento paso a paso:
1. Colección de muestras:
- Preparación:
- Utilice guantes esterilizados y utilice técnicas asépticas.
- Asegúrese de que los hisopos y el medio de transporte estén estériles y listos para su uso.
- Hisopo:
- Frote suavemente el hisopo en el área sospechosa (p. ej., cultivo celular, garganta, área urogenital) para recolectar la muestra.
- Coloque el hisopo en el medio de transporte inmediatamente para conservar la muestra.
2. Extracción de ADN:
- Lisis:
- Transfiera el hisopo a un tubo que contenga tampón de lisis del kit de extracción de ADN.
- Incubar según las instrucciones del kit para lisar las células y liberar ADN.
- Purificación:
- Siga el protocolo del kit de extracción de ADN para purificar el ADN. Por lo general, esto implica unir el ADN a una columna, eliminar los contaminantes y eluir el ADN purificado.
3. PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa):
- Prepare la mezcla de PCR:
- Prepare una mezcla maestra que contenga:
- Plantilla de ADN (del paso de extracción)
- Cebadores específicos de micoplasma
- dNTP
- Polimerasa taq
- Solución tampón
- Amplificación:
- Configure la máquina de PCR con las condiciones de ciclo adecuadas (normalmente desnaturalización inicial, seguida de ciclos de desnaturalización, recocido y extensión).
- Detección:
- Para la PCR de punto final, ejecute los productos amplificados en un gel de agarosa y tiñe con un tinte de unión al ADN (por ejemplo, bromuro de etidio) para visualizar bandas bajo luz ultravioleta.
- Para la PCR en tiempo real, controle la amplificación en tiempo real utilizando un tinte o sonda fluorescente.
Interpretación de resultados:
- Resultado positivo:
- La presencia de bandas específicas en la electroforesis en gel o una señal positiva en la PCR en tiempo real indica la presencia de ADN de Mycoplasma.
- Resultado negativo:
- La ausencia de bandas específicas o ninguna señal de amplificación sugiere la ausencia de ADN de Mycoplasma.
Consideraciones adicionales:
- Controles:
- Incluye controles positivos y negativos en tu PCR para validar los resultados.
- Prevención de la contaminación:
- Utilice áreas separadas para la preparación de muestras, configuración de PCR y análisis para evitar la contaminación.
- Limpie periódicamente las superficies de trabajo y el equipo con agentes degradantes del ADN.
Este proceso garantiza una detección precisa de Mycoplasma en sus muestras. Para aplicaciones clínicas, siga siempre las pautas y protocolos recomendados por las autoridades e instituciones sanitarias pertinentes.
