¿Cuáles son los pasos necesarios para la extracción por PCR?

La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica utilizada para amplificar secuencias de ADN. El proceso en sí se llama amplificación por PCR en lugar de extracción, pero a menudo implica la extracción inicial de ADN de células o tejidos. Estos son los pasos generales para la PCR:

1. Extracción de ADN

Antes de la PCR, es necesario extraer el ADN de las células. Esto implica varios pasos:

a. Coleccion de muestra

• Recolecte células o tejidos de la fuente (p. ej., sangre, saliva, biopsia de tejido).

b. lisis celular

• Abra las células para liberar el ADN utilizando métodos físicos (como molienda o sonicación) o métodos químicos (usando detergentes y enzimas).

c. Purificación de ADN

• Elimine proteínas y otros contaminantes mediante extracción con fenol-cloroformo, precipitación con etanol o kits comerciales de extracción de ADN.

2. amplificación por PCR

Una vez que tengas el ADN purificado, puedes proceder con la amplificación por PCR:

a. Preparación de la mezcla de reacción de PCR

• Plantilla de ADN: El ADN extraído que contiene la secuencia objetivo que se va a amplificar.
• Primeros: Secuencias cortas de ADN monocatenario que son complementarias a las secuencias flanqueantes de la región de ADN objetivo.
• dNTP (trifosfatos de desoxinucleótidos): Los componentes básicos para la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
• Taq ADN polimerasa: Enzima termoestable que sintetiza las nuevas cadenas de ADN.
• Solución tampón: Mantiene el pH y la fuerza iónica óptimos para la reacción.
• MgCl₂: Cofactor necesario para la actividad de la Taq polimerasa.

b. Pasos del termociclado

La mezcla de reacción de PCR se coloca en un termociclador, que cambia la temperatura en ciclos. Los principales pasos de cada ciclo son:

• Desnaturalización (94-98°C): El ADN bicatenario se funde y se abre formando hebras simples.
• Recocido (50-65°C): Los cebadores se unen (hibridan) a sus secuencias complementarias en el ADN monocatenario.
• Extensión (72°C): La Taq polimerasa agrega dNTP a los cebadores, extendiendo la cadena de ADN y sintetizando la nueva cadena complementaria.

c. Cycling

• El termociclador repite estos pasos durante 20 a 40 ciclos, lo que lleva a una amplificación exponencial de la secuencia de ADN objetivo.

3. Análisis post-PCR

Después de la amplificación por PCR, los productos se pueden analizar mediante varios métodos:

• Electroforesis en gel: Visualizar los fragmentos de ADN amplificados.
• secuenciación: Determinar la secuencia exacta del ADN amplificado.
• Cuantificación: Usar métodos como qPCR (PCR cuantitativa) para medir la cantidad de ADN.

Estos son los pasos generales de la PCR, desde la extracción del ADN hasta la amplificación y el análisis. Los detalles específicos pueden variar según la aplicación y el tipo de PCR que se realice.